由于石墨烯基材料（GRMs）的生物相容性和高運(yùn)載能力，它可能代表了一種理想的大腦輸送系統(tǒng)。石墨烯基材料到達(dá)大腦的能力主要是在體內(nèi)進(jìn)行的調(diào)查，并突出了一些爭(zhēng)議。在此，我們采用了兩種復(fù)雜性不斷增加的體外BBB模型來(lái)研究與氧化石墨烯（GO）和幾層石墨烯（FLG）的仿生相互作用：二維小鼠Transwell模型，然后是三維人類多細(xì)胞集合體，以模仿體內(nèi)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和細(xì)胞間的串?dāng)_。我們開發(fā)了特定的方法來(lái)評(píng)估GO和FLG在無(wú)標(biāo)簽方式下的轉(zhuǎn)移，以及一個(gè)適用于任何納米材料的平臺(tái)。總的來(lái)說(shuō)，我們的結(jié)果顯示這兩種GRM具有良好的生物相容性，不影響屏障的完整性和功能。充分分散的GO和FLG亞群被內(nèi)皮細(xì)胞積極吸收；然而，這種轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是一種罕見的事件。
圖1. 接觸GRM后BBB特性的描述。暴露于10μg/mL的GO（A）或FLG（B）48小時(shí)后，在玻璃蓋玻片上播種的bEnd.3單層細(xì)胞中，ZO-1（綠色）的免疫熒光染色的代表性共聚焦圖像。Hoechst染料用于核子的可視化（藍(lán)色）。GRM顆粒在光反射模式（LR）模式下是可見的（粉紅色）。BF表示亮場(chǎng)圖像。比例尺。50μm。(C）暴露于10μg/mL的GO和FLG 6、24和48小時(shí)后的TEER值。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，其值都被歸一化，并以平均值±SD表示（n=9個(gè)獨(dú)立的制備）。(D）暴露于10μg/mL的GO和FLG 6和48小時(shí)后，F(xiàn)D4的表觀滲透性（Papp，%）。沒有細(xì)胞的Transwell（空）的Papp表示為100%，數(shù)值相應(yīng)地被歸一化。數(shù)值表示為平均值±SEM（n = 3）。
圖2. GO和FLG的攝取動(dòng)力學(xué)和內(nèi)化途徑。代表性的TEM顯微照片顯示GO（A）和FLG（B）薄片在bEnd.3細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)化。在左邊的低倍顯微鏡照片中，N表示細(xì)胞核。(C) GO和FLG(10 μg/mL)在bEnd.3細(xì)胞單層中暴露于這些材料2、6、24和48小時(shí)的吸收動(dòng)力學(xué)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM（n = 3個(gè)獨(dú)立制備）。*p < 0.05, ***p < 0.001, 非配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)。在沒有或存在不同的內(nèi)吞作用抑制劑（CPZ、CYTD、NOC）的情況下，暴露2小時(shí)后細(xì)胞對(duì)GO（D）和FLG（E）（10 μg/mL）的吸收。平均數(shù)±SEM，n = 3。** p < 0.01, ***p < 0.001, 單向方差分析/Tukey檢驗(yàn)。所有攝取量的測(cè)量是由SSC在流式細(xì)胞儀中完成的，并在未處理的細(xì)胞（CTRL）上進(jìn)行歸一化處理。
圖3. GO和FLG在bEnd.3細(xì)胞單層上的轉(zhuǎn)位。(A) 兩種GRM片穿過二維BBB模型的過程示意圖。(B）用10μg/mL的GO或FLG培養(yǎng)24小時(shí)的bEnd.3細(xì)胞的代表性共聚焦XY平面和Z投影。細(xì)胞用Hoechst（細(xì)胞核，藍(lán)色）和ZO-1抗體（綠色）進(jìn)行染色。比例尺。50μm。(C）去除細(xì)胞后的Transwell膜（BF）的代表Z投影圖。一些GO和FLG的片狀物在膜上易位，可見粉紅色（LR模式）。比例尺：20μm。(D）基底層餾分的分析：基底層餾分中發(fā)現(xiàn)的石墨烯團(tuán)塊的代表性拉曼光譜和相應(yīng)的樣品區(qū)（插圖中的BF圖像）。
圖4. 與線性彎曲、Hencky解和FvK模型相比，GPH膜相對(duì)于徑向位置的偏轉(zhuǎn)。（a） 254 nm的膜厚加壓至ΔP=21 kPa。（b） 夾緊膜邊緣周圍（a）的放大。（c） 65 nm的厚度加壓至ΔP=68 kPa。（d） 夾緊膜邊緣周圍（b）的放大。（e） 加壓至ΔP=116 kPa的45 nm厚度。（f） 夾緊膜邊緣周圍（e）的放大。
圖5. GO和FLG與BBB的三維人類多細(xì)胞集合體模型的相互作用：流式細(xì)胞儀和TEM分析。(A) 預(yù)染hMCA形成和解離的工作流程示意圖。(B) NHA、hBPV和hCMEC/D3的三個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)物在流式細(xì)胞儀上一起運(yùn)行時(shí)，SSC與FSC（前向散射）的點(diǎn)圖和細(xì)胞追蹤器紅色（星形膠質(zhì)細(xì)胞）和綠色（周細(xì)胞）的門控。(C) 解離的hMCA的SSC與FSC和細(xì)胞追蹤器紅色（星形膠質(zhì)細(xì)胞）和綠色（周細(xì)胞）的點(diǎn)陣圖。(D) 在流式細(xì)胞儀上獨(dú)立運(yùn)行的三種細(xì)胞類型（NHA、hBPV和hCMEC/D3）的平均SSC定量。(E) 三個(gè)細(xì)胞型（NHA、hBPV和hCMEC/D3）在hMCA解離后的平均SSC定量。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM（n = 2）。(F) 不同細(xì)胞型對(duì)GO和FLG的吸收，以SSC的倍數(shù)比對(duì)照細(xì)胞增加表示。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM（n = 3）。暴露于GO（G）和FLG（H）的hMCA的TEM顯微照片，顯示了周邊細(xì)胞層的罕見材料內(nèi)化。
相關(guān)研究成果由意大利理工學(xué)院Valentina Castagnola和Fabio Benfenati 等人2023年發(fā)表在Nano Letters (https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c00377)上。原文：Interactions of Graphene Oxide and Few-Layer Graphene with the Blood–Brain Barrier。
轉(zhuǎn)自《石墨烯研究》公眾號(hào)
